Detecção e genotipagem de HPV

|BIOLOGIA MOLECULAR|


GENERALIDADES


A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é a doença sexualmente transmissível (DST) mais freqüente na população sexualmente ativa, tanto em homens quanto em mulheres. Os aspectos gerais da infecção pelo HPV já foram abordados no Tópico de Patologia Clínica BM7.

O maior avanço em relação ao diagnóstico do HPV nos últimos anos foi o aumento do número de tipos identificados. Mais de 200 diferentes tipos de HPV já foram descritos e reclassificados em grupos distintos, de acordo com o risco de progressão a lesões pré-malignas. A tecnologia mais avançada disponível em nosso meio permite a identificação dos seguintes tipos:

Baixo risco: 6, 11, 40, 42, 43 e 44/55
Alto risco: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 e 82

Conforme literatura disponível, os tipos 16 e 18 são responsáveis por 70% dos casos de câncer de cérvice uterina. A maioria das infecções são transitórias e assintomáticas, sendo resolvidas pelo sistema imunológico sem a presença de anormalidades celulares. Entretanto, infecções persistentes pelo mesmo tipo de HPV de alto risco aumentam a probabilidade de desenvolvimento de neoplasias.


METODOLOGIA


O método mais utilizado até o momento para a detecção do DNA do HPV é a Captura Híbrida, também já abordado no Tópico de Patologia Clínica BM7. Este método não faz uso da amplificação gênica e possibilita somente uma avaliação qualitativa (presença ou ausência) do vírus, sem identificar o genótipo envolvido. A diferenciação de tipos de alto e baixo risco somente é possível com a utilização de duas dessas reações e co-infecções não são identificadas.

Diversos avanços têm ocorrido na área de diagnóstico molecular para o HPV, introduzindo-se metodologias que permitem, além da detecção da presença do vírus, determinar qual tipo está envolvido (genotipagem).

Uma nova metodologia, conhecida como Micro-array (Biochip), permite a combinação da reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização, possibilitando a identificação do tipo viral envolvido, além da presença de co-infecções. A caracterização de tipos de alto e baixo risco acontecem na mesma reação, com sensibilidade superior à técnica de Captura Híbrida.

O Micro-array consiste na hibridização do produto da PCR em uma superfície sólida revestida com sondas específicas para os diferentes tipos virais. Essas sondas estão ligadas a um marcador fluorescente, sendo responsável por indicar a presença do DNA viral amplificado. Cada tipo de HPV é detectado por uma sonda específica, evitando a ocorrência de reações cruzadas. A possibilidade de detecção de mais de um tipo viral na mesma reação fornece um resultado não disponível em outras metodologias. A avaliação da persistência de um tipo viral, ou mesmo situações de re-infecção somente podem ser avaliadas através de metodologias que permitam genotipar o vírus. Esta técnica fornece uma relação entre a fluorescência presente na amostra e a fluorescência de base do equipamento (SNR - Signal Noise Ratio), que está relacionada com a carga viral. Considera-se um resultado positivo quando o SNR for superior a 12.

Deve-se considerar que, mesmo após um resultado positivo dos testes de detecção do DNA HPV, o diagnóstico definitivo das lesões intra-epiteliais escamosas só é possível após o exame colpocitológico e/ou exame histológico do material das biópsias colposcópicas.


MODELO DE RESULTADO


Os resultados são expressos qualitativamente e semi-quantitativamente (SNR) para os 25 tipos de baixo e alto risco pesquisados simultaneamente. A seguir, um exemplo de resultado positivo para HPV tipo 16 e 66 e negativo para os demais tipos pesquisados.


HPV (Papiloma Virus Humano) - Detecção e Genotipagem


material:___________________________

Resultado - tipos de baixo risco pesquisados:

Tipo
SNR
Tipo
SNR
6 : negativo
0
11: negativo
0
40: negativo
0
42: negativo
0
43: negativo
0
44/55: negativo

Resultado - tipos de alto risco pesquisados:

Tipo
SNR
Tipo
SNR
16: positivo
250
18: negativo
0
31: negativo
0
33: negativo
0
35: negativo
0
39: negativo
0
45: negativo
0
51: negativo
0
52: negativo
0
53: negativo
0
56: negativo
0
58: negativo
0
59: negativo
0
66: positivo
750
68: negativo
0
70: negativo
0
73: negativo
0
82: negativo
0

Sensibilidade analítica: 150 cópias/amostra.

SNR: valores sugestivos de carga viral na amostra; considera-se resultado positivo quando >12.

Método: Micro-array (Greiner)
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LEITURAS SUGERIDAS


1) Mayrand MM, Duarte-Franco E, Rodrigues I, Walter SD, Hanley J, et al. Human Papillomavirus DNA versus Papanicolaou Screening Tests for Cervical Cancer. N Eng J Med. 2007;357:1579-1588.

2) Castle P, Sadorra M, Garcia F, Holladay EB, Kornegay J. Pilot Study of a Commercialized Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Assay: Comparison of HPV Risk Group. to Cytology and Histology. J Clin Microbiol. 2006;44:3915-3917.
Justificar
3) Burd EM. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1-17.
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Autor:
Diogo André Pilger
Contato: dpilger@weinmann.com.br

Data:
Março-Abril 2008
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