PCR quantitativo em tempo real

|BIOLOGIA MOLECULAR|


GENERALIDADES


A PCR em tempo real (Real-Time PCR) representa o último avanço na tecnologia da PCR (Polymerase Chain Reaction). Todos os testes diagnósticos que envolvem um método molecular de amplificação, como a PCR, compreendem as etapas de extração de ácidos nucléicos de amostras biológicas, seguido de amplificação de um segmento selecionado mediante a reação em cadeia de polimerase e de detecção dos fragmentos amplificados durante o processo. A PCR em tempo real associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção e quantificação de fluorescência produzida durante os ciclos de amplificação. A metodologia permite a amplificação, detecção e quantificação de DNA em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e minimizando o risco decorrente de possíveis contaminações. A possibilidade de monitorar, ao longo da reação, a quantidade de produto formado a cada ciclo de amplificação e de quantificar este produto durante a sua fase ótima de formação, confere maior precisão e reprodutibilidade à PCR em tempo real quando comparado com a PCR convencional.

Por suas vantagens, a PCR em tempo real tende a substituir a PCR convencional como método molecular de auxílio diagnóstico.


METODOLOGIA


Os aspectos metodológicos da PCR convencional foram abordados no Tópico de Patologia Clínica BM-1 (POLYMERASE CHAIN REACTION).

Os equipamentos, destinados à realização de PCR em tempo real, associam um termociclador a um leitor de fluorescência capaz de medir a luz proveniente de uma reação de amplificação. A metodologia utiliza os mesmos reagentes de uma PCR convencional acrescido de fluorocromos, intercalados em cadeias de DNA (metodologia SybrGreen) ou presentes em sondas de hibridização específicas (metodologia TaqMan). Na presença de produto amplificado, os fluorocromos, excitados por uma fonte de luz (laser), emitem um sinal proporcional à quantidade de produto sintetizado que, por sua vez, será proporcional à quantidade inicial de seqüências-alvo presentes na reação de amplificação.

Os sinais são detectados por um sistema óptico e analisados por software específico. Os sinais de fluorescências, produzidos à medida que o produto é amplificado, são expressos graficamente (sinais de fluorescência versus número de ciclos) permitindo monitorar, em tempo real, a cinética e a eficiência da reação de amplificação (vide figura a seguir).
pcr quantitativo

Os ciclos iniciais de amplificação, caracterizados por reduzidos incrementos nos sinais de fluorescência, definem o limiar de detecção. A metodologia permite monitorar, em tempo real, o momento da reação em que a fluorescência emitida pelo produto amplificado ultrapassa o limiar de detecção (indicado por CT na figura). O ponto CT indica o momento a partir do qual a reação é otimizada (fase exponencial) e o produto amplificado é quantificado.

A quantificação do produto amplificado é realizada através de comparação com uma curva padrão que correlaciona a intensidade dos sinais de fluorescência, gerados durante os ciclos de amplificação, com as concentrações conhecidas de uma seqüência idêntica a que se quer quantificar.

A PCR em tempo real é altamente sensível, sendo capaz de detectar até 10 cópias de DNA/mL.

A especificidade da reação é confirmada através de uma curva (Curva de Melting), que indica o ponto correspondente à temperatura de dissociação dos primers específicos para as seqüências-alvo que estão sendo pesquisadas.


APLICAÇÃO DA PCR EM TEMPO REAL NA PRÁTICA CLINICA


Estudos clínicos validaram o uso da PCR em tempo real para uma ampla gama de aplicações. Entre outras, a PCR em tempo real pode ser aplicada:

- Identificação, quantificação e caracterização genética de vírus (HIV, vírus da hepatite B e C e Citomegalovírus), bactérias (Escherichia coli e Staphylococcus aureus), micobactérias (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium e Mycobacterium intracelullare) e fungos (Pneumocistis carinii);
- Determinação quantitativa de transcritos como o BCR-ABL e de translocações (9;22), característicos da leucemia mielóide crônica;
- Determinação de pontos de mutações genéticas.

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LEITURAS SUGERIDAS

1) MACKAY, I.M. et al. Real-time PCR in virology. In: Nucleic Acids Research 30(6): 1292-1305, 2002.

2) MACKAY, I.M. et al. Real-time PCR in the microbiology laboratory. In: Clin Microbiol Infect 10(3): 190-212, 2004.

3) SAUNDERS, N.A. Real-time PCR In: Methods Mol Biol 266: 191-211, 2004.

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Autor:
Fabiana Pereira e Lila Maciel
Contato: fpereira@weinmann.com.br

Data: Julho-Agosto/2004
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