Validação de metodologia de Microarray (PapilloCheck®) para detecção de genótipos de HPV e estudo de prevalência em amostras genitais

Tarissa Torres Moreira, Diogo André Pilger , Vlademir Cantarelli

INTRODUÇÃO

O câncer de colo do útero (CCU) é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres no mundo. Estima-se que surjam em torno de 493.000 novos casos por ano com aproximadamente 270.000 mortes. (2,6,7,8,12,13,16,22) Diversos trabalhos evidenciam claramente que certos genótipos do Papiloma Vírus Humano (HPV) estão etiologicamente relacionados ao CCU. (14)

A ligação entre infecções genitais pelo HPV e o CCU foi inicialmente demonstrada na década de 1980, pelo virologista alemão Harold zur Hausen. Desde então, uma evidente relação entre o HPV e o CCU foi estabelecida, sendo atualmente considerada maior, por exemplo, do que a existente entre o fumo e o câncer de pulmão (1). Atualmente, o HPV está relacionado a 99,7% dos casos de CCU em todo o mundo. Adenocarcinomas da cérvice uterina também são relacionados ao HPV, mas a correlação é menos pronunciada e dependente da idade dos pacientes. (1)

O HPV é um vírus não envelopado capaz de infectar tecidos epiteliais humanos, incluindo pele, epitélio ano-genital, epitélio oral e cavidade de mucosas. A infecção genital é transmitida diretamente por contato sexual, indiretamente por contato com objetos contaminados e raramente por transmissão vertical. (16)

O genoma do HPV consiste em uma dupla fita de DNA circular que contém aproximadamente 7900 bp com 8 a 9 janelas de leitura (open reading frame) e uma região regulatória. O vírus não sintetiza nenhuma enzima, assim, depende do hospedeiro para completar seu ciclo de vida, sendo hermeticamente ligado ao programa de diferenciação da célula epitelial infectada. (16) O HPV possui duas proteínas regulatórias chamadas proteínas precoces (early) E1 e E2, três importantes oncogenes E5, E6 e E7 e duas proteínas do capsídeo, tardias (late) L1 e L2. (11,19) As proteínas virais precoces são expressas nas células basais infectadas e dentro das camadas epiteliais mais baixas. Quando as células infectadas alcançam a superfície, a produção das proteínas tardias permite o desprendimento dos virions maduros. (16)

Os oncogenes E6 e E7 são os responsáveis pela transformação maligna das células infectadas, interferindo na função das proteínas-chave da supressão tumoral através dos genes p53 e retinoblastoma (pRb), prolongando o ciclo celular através da supressão da apoptose e contribuindo para o desenvolvimento das lesões associadas ao HPV.(13,16,17,19)

Existem mais de 100 tipos conhecidos de HPV, dos quais 40 têm tropismo especialmente pela mucosa ano-genital. São classificados como baixo risco ou alto risco, baseados no seu potencial em provocar lesões malignas. (14,20,3) Dessa maneira, são classificados como alto risco (High-Risk - HR) os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82. Já os tipos 26, 53 e 66 são classificados como “provavelmente de alto risco”. (14,20) Doze tipos (6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81 e CP6108) foram classificados como baixo risco (Low-Risk - LR) e três tipos (34, 57 e 83) foram associados a um risco indeterminado. (14)

A infecção persistente por HPV-HR tem sido demonstrada como um fator causal necessário para o desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial cervical e potencial progressão ao CCU. (7,10,17,20)

Em aproximadamente todos os casos de CCU têm sido encontrados genótipos de HPV-HR, com proporções decrescentes encontradas entre lesões de alto risco e baixo risco, respectivamente. Muitas infecções por HPV são transitórias e assintomáticas e são eliminadas pela imunidade do hospedeiro sem conduzir a anormalidades celulares. (20)

Um grande percentual de mulheres adquire uma nova infecção por HPV a cada ano sendo que em mulheres mais velhas é mais comum a persistência da infecção e o desenvolvimento de uma lesão cancerosa. Estudos epidemiológicos têm mostrado que o HPV 16 e o HPV 18 são os tipos mais comuns, estando presentes em infecções simples ou múltiplas em até 70% dos cânceres cervicais invasivos. (7,3) O HPV 16 e/ou 18 são encontrados em 45% das lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau (NIC2 ou 3) e o HPV 16 está presente em aproximadamente 25% das lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (NIC1). O HPV 16 é a causa mais prevalente de câncer cervical, ocorrendo em 55% dos carcinomas escamosos e 31% dos adenocarcinomas.

O HPV 18, por outro lado, causa 12% dos carcinomas escamosos, com um adicional de 38% dos adenocarcinomas. Seis outros tipos de HPV (45,31,33,52,58 e 35) são os responsáveis por 19% dos cânceres cervicais, e desses os mais importantes são os tipos 45 e 31, que são encontrados em 10% dos casos. Até hoje, o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra o HPV estão focadas nos tipos 16 e 18, 11 e 6. (7)

Vários outros fatores provavelmente estão envolvidos na carcinogênese: (1) Fatores ambientais ou exógenos, incluindo contraceptivos hormonais, fumo, paridade e coinfecção com outros agentes transmitidos sexualmente; (2) fatores virais, como infecção por tipos específicos, coinfecção com outros tipos de HPV, HPVs variantes, carga viral e integração viral; (3) fatores do hospedeiro, como hormônios endógenos, fatores genéticos e outros fatores relacionados à resposta imune.(13)

Diversos estudos têm mostrado que testes para detecção de HPV-HR, utilizados como uma ferramenta adjunta à citologia, podem melhorar a eficácia dos programas de screening na detecção de lesões subjacentes ou seu subsequente desenvolvimento, para mulheres com lesões citológicas menores ou equívocas. Além disso, permitem o seguimento para mulheres tratadas para lesões de alto grau para predizer um sucesso ou falha no tratamento. (20)

As principais metodologias empregadas para avaliação laboratorial da presença do HPV envolvem os métodos moleculares de captura híbrida e Reação da Cadeia da Polimerase (PCR). Atualmente, metodologias mais avançadas, como o microarray permitem, além da avaliação da presença ou ausência do vírus, também a genotipagem do vírus.

O kit da Captura Híbrida Digene (HC2) é o único atualmente aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para a detecção do DNA do HPV em amostras cervicais. (10,22) A sensibilidade analítica deste ensaio varia de 6.6 a 17.6 pg/mL dependendo do tipo de HPV. Como em qualquer ensaio, existem algumas limitações na Captura Híbrida. As mais comuns são as reações cruzadas observadas, podendo levar a resultados falso-positivos. Resultados falso-negativos são estimados em 1.1 a 7.5% das determinações e podem ocorrer devido a baixos níveis de infecção viral, erro na amostra ou presença de substâncias interferentes, como cremes antifúngicos, contraceptivos em gel ou duchas (1).Além disso, limita-se à diferenciação entre HPV de alto e baixo risco, não fornecendo o genótipo viral envolvido. (2,12)

Um método alternativo para a detecção e genotipagem de HPV é a tecnologia microarray (PapilloCheck®, Greiner Bio-One GmbH, Germany) baseado na amplificação do genoma viral através do PCR e posterior hibridização com sondas específicas para os diferentes tipos de HPV, capaz de detectar e identificar simultaneamente 24 genótipos distintos de HPV.

O objetivo desde estudo é comparar a metodologia de microarray (PapilloCheck – Greiner BioOne) com o método de referência (Captura Híbrida – Digene) para detecção de HPV em amostras genitais e estimar a prevalência dos principais tipos virais, índices de coinfecção e associação dos tipos mais prevalentes em amostras de pacientes submetidos a investigação laboratorial.

MATERIAIS E MÉTODOS

Para o estudo de prevalência viral foram utilizadas 1144 amostras de pacientes submetidos à investigação laboratorial da presença de HPV no Laboratório Weinmann, sem condição clínica conhecida, coletados sequencialmente durante o período de maio de 2008 a abril de 2009 As amostras foram coletadas no meio de transporte Universal Collection Medium (Digene) e armazenadas sob refrigeração até posterior análise. Uma fração em torno de 15% do total de amostras coletadas (n = 176) foi utilizada para o estudo de comparação entre as metodologias de Captura Híbrida e microarray (PapilloCheck®). Ressalta-se que neste estudo comparativo foram consideradas para análise somente as amostras que apresentavam HPV-HR.

O teste de HC2 (Digene Corporation) foi utilizado seguindo o protocolo preconizado pelo fabricante, constituído basicamente por cinco etapas: desnaturação da amostra a 65°C por 45 minutos, hibridização, captura dos híbridos, reação dos híbridos com o conjugado e detecção dos híbridos por quimioluminescência. Reagindo com sonda gênica específica, o material para análise forma híbridos de RNA/DNA que são capturados por anticorpos que revestem as paredes de tubos ou microplaca. A seguir, os híbridos imobilizados reagem com anti-anticorpos específicos conjugados à fosfatase alcalina formando substrato estável que é posteriormente detectado por quimioluminescência ultra-sensível. A carga viral é estimada em unidades relativas de luz emitidas (relative light units – RLU).

A Captura Híbrida para HPV-HR possui sensibilidade analítica de 1pg/ml, equivalente 0,1 cópia de vírus por célula. Utiliza sondas de RNA altamente específicas para detectar os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68.

O teste de microarray (PapilloCheck®, Greiner BioOne) é baseado na detecção do fragmento do gene E1 de 24 diferentes tipos de HPV. Inicialmente o DNA humano e viral é extraído com o kit Qiamp DNA (Qiagen). Posteriormente um fragmento de aproximadamente 350 pares de bases do gene é amplificado através da reação de PCR. Resultados falso-negativos são evitados pela amplificação conjunta do gene humano ADAT1 (Adenosina deaminase 1). Um segundo passo consiste na hibridização dos produtos da reação anterior por 15 minutos à temperatura ambiente em lâminas revestidas com probes específicas para cada tipo viral analisado. Finalmente, a lâmina é lavada e a fluorescência resultante é automaticamente analisada em um escâner específico. O kit faz a detecção e genotipagem simultânea de 24 diferentes tipos de HPV, sendo 7 de baixo risco (6, 11, 40, 42, 43, 44 e 70), 17 de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82).

Ocasionalmente, foi utilizada uma terceira metodologia para solucionar resultados discordantes entre as duas metodologias anteriores. Esta metodologia consiste na amplificação do gene através de PCR convencional (MY 09/11) e/ou Real-time PCR e detecção posterior em gel de agarose.

Para análise estatística dos resultados foi utilizado o software SPSS versão 16.0.

RESULTADOS

Das 1144 amostras analisadas, 1004 (87,8%) foram do sexo feminino e 140 (12,2%) do sexo masculino. A média de idade foi 31,6 anos para as mulheres e 33,5 para os homens. Os pacientes positivos para HPV16 apresentaram-se mais jovens, com média de idade de 27,9 anos enquanto que a média de idade para os pacientes negativos para este subtipo foi de 32,1 anos (p<0,001).

Do total de amostras analisadas, 485 (42,4%) apresentaram ao menos a presença de um tipo de HPV e os 57,6% restantes apresentaram resultados indetectáveis pela metodologia de microarray.

Dentre os 485 pacientes com resultados positivos, considerando ambos os sexos, os tipos de alto risco mais prevalentes foram o HPV16 (19,0%), HPV56 (15,9%), HPV51 (12,0%) e HPV31 (9,1%). Os tipos de baixo risco mais prevalentes foram o HPV42 (10,5%), HPV6 (8,5%), HPV44 (8,5%) e o HPV11 (6,0%). Entre homens e mulheres não houve diferença estatisticamente significativa entre os tipos pesquisados (Tabela 1). Foram observados 206 (42,5%) casos de coinfecção, sendo que 105 (51,0%) amostras apresentaram infecção por 2 tipos de HPV, 45 (21,8%) por 3 tipos, 32 (15,5%) por 4 tipos, 15 (7,3%) por 5 tipos e 9 (1,9%) por mais de 5 tipos de HPV, conforme demonstrado na tabela 2. Os subtipos de alto risco HPV16, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV56, HPV59, HPV68, HPV73 e HPV82, foram mais frequentes na presença de coinfecção do que na infecção simples (p<0,001).

Dos pacientes considerados positivos, somente 8 (1,6%) foram avaliados mais de uma vez, o que possibilitaria a avaliação de persistência viral. Para estas amostras, todas do sexo feminino, os subtipos de alto risco mais frequentes foram HPV31, HPV33, HPV39, HPV45, HPV53 e HPV68, conforme observado na tabela 3.

No estudo da comparação entre as duas metodologias, o coeficiente kappa Cohens de foi de k=0,68., resultado considerado como de fraca concordância. A concordância específica entre os resultados positivos foi de 92,2% e entre os negativos de 76,0%. Os resultados foram concordantes para 148 amostras (91 positivas e 57 negativas). Dezesseis amostras foram consideradas positivas pelo HC2, 10 destas foram negativas pelo PapilloCheck® e 6 continham tipos de baixo risco, sugerindo reação cruzada entre as probes de alto risco no sistema HC2 com alguns tipos de HPV de baixo risco (como o 11 e 42). Doze amostras foram consideradas negativas pelo HC2 e positivas pelo PapilloCheck® (Tabela 4). As amostras discordantes foram novamente analisadas utilizando o PCR convencional (MY 09/11). Todas essas amostras continham no mínimo um tipo de HPV-HR, e foram consideradas falso-negativas pelo HC2. Em amostras com alta carga viral, como sugerido por altos valores RLU no HC2, os índices de positividade dos diferentes métodos de genotipagem e a concordância entre os testes aumenta. Pode ser claramente visto que o número de amostras, quando todos os testes são discordantes nos seus resultados, diminui de 15%, em amostras com um valor HC2 RLU <0,5, para abaixo de 1% em amostras com valor de RLU acima de 100. Portanto, um resultado de um teste de HPV de um teste de genotipagem individual foi considerado verdadeiro positivo ou verdadeiro negativo, se no mínimo dois testes de genotipagem deram um resultado concordante para aquele tipo particular de HPV.

DISCUSSÃO 

O DNA de HPV-HR é detectado em 99% dos CCU (4,5). A infecção persistente por HPV-HR tem sido demonstrada como uma das principais causas de CCU no mundo (4,15). A prevalência de HPV encontrada em nosso estudo (42%) foi discretamente mais elevada do que a descrita na literatura, que varia de 15 a 40% na população em geral (18).

Diversos estudos reportam que o HPV 16 é o responsável por quase a metade dos cânceres cervicais no mundo sendo o subtipo mais prevalente nos diversos trabalhos realizados (4). Nossos resultados estão de acordo com estes dados, com uma prevalência de 19%. Porém, quando avaliados homens e mulheres separadamente o HPV16 foi o mais prevalente nas mulheres, nos homens o tipo que apareceu mais frequentemente foi o HPV51 (16,0%), seguido do HPV16 (14,0%), embora não houvesse diferença significativa em relação às mulheres. Já o HPV 18, considerado o segundo tipo mais prevalente em vários estudos (5), foi detectado somente em 5,8% do total de amostras analisadas, sendo em 6,0% das mulheres e 4,0% dos homens o que sugere que esse subtipo não é um dos mais prevalentes na nossa região. O segundo tipo mais prevalente nas mulheres, dentre os HPVs de alto risco, foi HPV56 (16,8%).

Esses resultados podem sugerir uma distribuição gênica do HPV diferente em nossa região ou simplesmente refletir a ausência, nas amostras analisadas, de estágios avançados na carcinogênese do CCU, no quais o HPV16 e o HPV18 parecem ser mais prevalentes. Um estudo englobando somente amostras com alterações citológicas sugestivas de CCU deverá ser realizado de modo a estabelecer qual o real papel de cada tipo viral encontrado. Entretanto, deve-se ressaltar que tipos virais até então pouco prevalentes em nosso meio, como o HPV56, HPV51 e HPV31 foram encontrados em nosso trabalho de maneira inédita na literatura.

Casos de coinfecção com múltiplos tipos oncogênicos de HPV podem afetar a persistência viral e a história natural da infecção por HPV. Alguns estudos têm sugerido um possível papel para a infecção com múltiplos tipos de HPV no desenvolvimento e progressão de neoplasia cervical, enquanto que outros têm mostrado que o risco para lesões pré-cancerosas cervicais ou câncer invasivo em mulheres infectadas com múltiplos tipos de HPV não é maior do que aquelas com infecção simples.(21) Em nosso trabalho, dos pacientes infectados, 42,5% apresentaram coinfecção por dois ou mais subtipos de HPV. Dos 15 tipos de alto risco avaliados, 10 mostraram-se mais frequentes em pacientes coinfectados do que naqueles com infecção simples. Os tipos virais mais encontrados na coinfecção foram o HPV56 (26,2%), HPV16 (25,7%), HPV51 (18,0%), HPV53 (18,0%), HPV42 (16,0%) e HPV66 (15,5%). O significado clínico dessas coinfecções na progressão à carcinogênese ainda necessita ser determinado.

Embora muitas infecções desapareçam espontaneamente sem maiores conseqüências em 1 a 2 anos, algumas infecções persistem. A infecção persistente com o mesmo tipo de HPV-HR aumenta fortemente o risco de lesões pré-cancerosas (4). Virtualmente todos os cânceres cervicais e seus precursores imediatos são consequência da infecção persistente por pelo menos 1 dentre os 15 tipos de HPV carcinogênicos. Dos 1144 pacientes avaliados, 8 (1,6%) realizaram avaliação prospectiva e apresentaram os mesmos tipos virais de HPV, sugerindo persistência da infecção viral, sendo todos eles do sexo feminino. Dentre estes pacientes, 5 apresentaram persistência por tipos de HPV-HR, o que leva a um aumento do risco de CCU. Os tipos de alto risco mais freqüentes na persistência viral foram HPV31, HPV33, HPV39, HPV45 e HPV68, diferentemente do encontrado por Howe (4) em que os subtipos mais frequentemente observados foram o HPV16, HPV31, HPV52 e HPV58. No entanto, uma maior amostragem e um acompanhamento por um período maior seria o ideal para uma melhor avaliação da persistência da infecção por HPV.

O valor de Kappa calculado para a comparação dos resultados dos tipos de HPV entre HC2 e PapilloCheck® foi baixo (k=0,68). Isto pode ser explicado pela provável reação cruzada entre as probes de alto risco do sistema HC2 e alguns tipos de HPV de baixo risco, além da falta de controle da HC2 para avaliação da qualidade da amostra coletada através, por exemplo, de um sistema da avaliação do DNA humano como utilizado no sistema de microarray. O PapilloCheck® permite a detecção de mais amostras positivas quando comparado ao HC2, pois em todos os casos falso negativos pelo HC2, os tipos de HPV detectados pelo PapilloCheck® pertenciam ao grupo de alto risco.

Futuros programas de screening deverão ser desenhados tendo em mente a persistência de HPV-HR, pois a persistência da infecção com tipos desse grupo é associada fortemente com o desenvolvimento de lesões de alto grau.(4) A tecnologia de microarray demonstrou ser uma potente ferramenta para a detecção de HPV, pois pode detectar tanto subtipos de alto risco como de baixo risco e, além disso, permite conhecer todos os tipos de HPV envolvidos numa infecção.

ANEXOS

Tabela 1: Frequência da infecção por cada tipo de HPV em homens e mulheres
Tipo Viral
SEXO FEMININO
 n=435
% dos casos
SEXO MASCULINO
n=50
% dos casos
p
HPV 6  
34
7,8%
7
14,0%
0,336
HPV11
25
5,7%
4
8,0%
0,796
HPV16 
85
19,5%
7
14,0%
0,158
HPV 18
26
6,0%
2
4,0%
0,405
HPV 31
42
9,7%
2
4,0%
0,112
HPV 33
33
7,6%
3
6,0%
0,468
HPV 35
15
3,4%
2
4,0%
0,952
HPV 39
34
7,8%
3
6,0%
0,436
HPV 40
17
3,9%
4
8,0%
0,337
HPV 42
43
9,9%
8
16,0%
0,442
HPV 43
16
3,7%
1
2,0%
0,420
HPV 44/55
37
8,5%
4
8,0%
0,621
HPV 45
18
4,1%
1
2,0%
0,350
HPV 51
50
11,5%
8
16,0%
0,711
HPV 52
39 
9,0%
1
2,0%
0,056
HPV 53
44
10,1%
2
4,0%
0,096
HPV 56
73
16,8%
4
8,0%
0,051
HPV 58
30
6,9%
2
4,0%
0,294
HPV 59
20
4,6%
3
6,0%
0,905
HPV 66
34
7,8%
4
8,0%
0,743
HPV 68
38
8,7%
2
4,0% 
0,155
HPV 70
26
6,0%
2
4,0%
0,405
HPV 73
21
4,8%
1
2,0%
0,266
HPV 82
13
3,0%
2
4,0%
0,896
**Legenda: p<0,001


Tabela 2:
Número de Infecções para os indivíduos HPV positivos
n
%
1
279
57,5
2
105
21,6
3
45
9,3
4
32
6,6
5
15
3,2
>5
9
1,8
Total
485
100
**Legenda:
1: pacientes infectados por 1 tipo de HPV;
2: pacientes infectados por 2 tipos de HPV;
3: pacientes infectados por 3 tipos de HPV;
4: pacientes infectados por 4 tipos de HPV;
5: pacientes infectados por 5 tipos de HPV;
>5: pacientes infectados por mais de 5 tipos.

Tabela 3: Avaliação do tipo de HPV em pacientes analisados prospectivamente

1 vez
2 vezes
Paciente A
HPV31,HPV43,HPV51,
HPV52
HPV31,HPV43,HPV51,
HPV52
Paciente B
HPV39, HPV45,HPV68
HPV39, HPV45
Paciente C
HPV33,HPV42,HPV51
HPV33,HPV42,HPV51
Paciente D
HPV39,HPV53,HPV68
HPV53,HPV68
Paciente E
HPV44,HPV68
HPV44,HPV68
Paciente F
HPV70
HPV70
Paciente G
HPV70
HPV70
Paciente H
HPV51
HPV51
**Legenda: Pacientes de A a H. Identificação anônima dos pacientes que realizaram análise prospectiva

Tabela 4: Resultados da comparação entre a Captura Híbrida e PapilloCheck para pesquisa de HPV

HC2 negativo
HC2 positivo
Total
Papillo Check
negativo
57
16
16
Papillo Check
positivo
12
91
91
Total
69
107
176
*Legenda: HC2: Captura híbrida


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